Mutacje w obrębie genu Rhodopsin u pacjentów z autosomalnym dominującym pigmentem siatkówki ad

Aby przeanalizować każdy ekson, jako matrycę do amplifikacji z jedną parą starterów zastosowano od 100 do 500 ng genomowego DNA. Zamplifikowane fragmenty oczyszczono i zastosowano jako matrycę do sekwencjonowania DNA, przeprowadzoną zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami.7 Jeden z oligonukleotydów zastosowanych do amplifikacji był również stosowany jako starter dla każdej reakcji sekwencjonowania. Badania przesiewowe o dużej skali dla mutacji kodonów 347 i 58 oraz dla polimorfizmu RsaI w Intron 3
Normalna sekwencja dla rodopsyny obejmuje sekwencję rozpoznawaną dla endonukleazy restrykcyjnej MspI, która obejmuje kodon 347. Dwie mutacje przerwały tę sekwencję rozpoznawaną (patrz Wyniki). Aby przetestować liczne próbki genomowego DNA pod kątem zmiany kodonu 347, fragmenty DNA zawierające sekwencję kodującą w eksonie 5, które zostały amplifikowane z DNA leukocytarnego każdego osobnika przez reakcję łańcuchową polimerazy zostały strawione za pomocą MspI. Podobnie, mutacja odkryta w kodonie 58 (patrz Wyniki) stworzyła nową sekwencję rozpoznawania dla DdeI. Aby przesłuchać próbki DNA od wielu osób pod kątem tej zmiany zasady, fragment DNA zawierający sekwencję kodującą w eksonie amplifikowano w reakcji łańcuchowej polimerazy, a następnie trawiono DdeI. RFLP RsaI w pobliżu 5 końca intronu 3 badano przez trawienie zamplifikowanego fragmentu DNA zawierającego eksony 3 i 4 za pomocą RsaI. W każdym przypadku trawione fragmenty DNA rozdzielano przez elektroforezę za pomocą 2% żelu agarozowego. Powstałe fragmenty DNA wybarwiono bromkiem etydyny i badano transiluminatorem w ultrafiolecie.
Test na polimorfizm powtórzenia dinukleotydu
Polimorfizm powtórzenia dinukleotydowego umiejscowiony w intronie genu rodopsyny8 testowano zgodnie z poprzednio opisanymi metodami. 9 Użyliśmy następujących starterów do amplifikacji fragmentu zawierającego około 329 par zasad (bp), który obejmował sekwencję polimorficzną: sens 5 -CTCTGGGCAAAACATTGCAC3 I antysensowny 5 -GAAGTTATTTGCTTAGCGCT-3 . Allele były ponumerowane od do 8, w zależności od wielkości powielonego fragmentu zawierającego powtarzającą się sekwencję; oznaczono największy zaobserwowany allel. Następujące częstości alleli stwierdzono u 99 zdrowych osób: allel 1, 0,0101; allel 2, 0,0; allel 3, 0,0101; allel 4, 0,101; allel 5, 0,1263; allel 6, 0,7273; allel 7, 0,0151; i allel 8, 0,0101.
Testowanie elektroretinograficzne
Reakcje elektryczne wywołane światłem z siatkówki były monitorowane u 150 pacjentów za pomocą elektrody kontaktowej umieszczonej na znieczulonej miejscowo rogówce po adaptacji do ciemności przez 45 minut; odpowiedzi zostały wzmocnione i sfotografowane z oscyloskopu, jak opisano wcześniej.10, 11 Pojedyncze niebieskie (0,5 Hz) błyski zostały użyte do wyizolowania odpowiedzi prętów, pojedyncze (0,5 Hz) białe błyski w celu wywołania połączonych reakcji stożka i pręta oraz białego migoczącego światła (30 Hz) w celu wyizolowania odpowiedzi na stożek. Odpowiedzi, gdy były wykrywalne (tj. Większe niż 10 .V), określano ilościowo w odniesieniu do amplitudy od szczytu do piku i odstępu między błyskiem bodźca a odpowiednim szczytem odpowiedzi rogówki (określanym jako czas nieuwodzeniowy fali b ). W tych warunkach testowych następujące są normalne zakresy amplitud szczytowych: niebieskie, od 100 do 275 .V; biały, od 350 do 700 .V; i białe migotanie, od 50 do 125 .V
[podobne: wazektomia opinie, endometrium w fazie sekrecji, sanvit iwonicz ]