Endogenne peptydy przeciwdrobnoustrojowe i infekcje skóry w atopowym zapaleniu skóry cd

Skrawki wybarwiono kontrastowo hematoksyliną. Specyficzność pierwotnej reakcji przeciwciała potwierdzono w oddzielnych doświadczeniach przez adsorpcję przeciwciała anty-LL-37 z nadmiarem ilości syntetycznego peptydu. Swoistość wtórnej reakcji przeciwciał i odczynników do barwienia immunologicznego potwierdzono przez rutynowe stosowanie króliczej surowicy nieimmunologicznej. Pomiar peptydów HBD-2 i LL-37
Próbki z biopsji skóry odważono, a następnie homogenizowano przez 10 minut za pomocą luźnego homogenizatora Dounce w ml M chlorowodoru i 1% kwasu trifluorooctowego na lodzie. Homogenizowane tkanki w roztworze następnie obracano przez noc w 4 ° C. Po odwirowaniu przez 20 minut przy 14000 rpm w 4 ° C, supernatanty przeniesiono do nowych probówek i całkowicie liofilizowano. Uzyskane peletki białka rozpuszczono w wodzie destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie białka wynoszące 0,1 mg tkanki na mikrolitr.
W celu pomiaru HBD-2, 15 .l każdej próbki ponownie liofilizowano i ponownie zawieszono w buforze dodecylosiarczanu sodu przez noc w 4 ° C. Próbki i znane ilości HBD-2 do stosowania jako wzorce gotowano następnie przez pięć minut i nanoszono na 16,5% żel poliakryloamidowy z dodecylosiarczanem sodu-tricyną. Próbki umieszczono na membranach Immobilon-PSQ (Millipore) na godzinę przy 0,18 mA w 0,05 M boranie sodu, pH 9,0, z 20 procentami metanolu i 0,05 procentami dodecylosiarczanu sodu. Plamki utrwalano przez 30 minut 0,5% aldehydem glutarowym w soli fizjologicznej buforowanej TRIS (500 mM chlorek sodu i 20 mM TRIS, pH 7,5), blokowano przez 30 minut w 0,75% Blotto (beztłuszczowe mleko w proszku) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (0,9%). chlorek sodu i 10 mM bufor fosforanu sodu, pH 7,4), następnie inkubowano przez 18 godzin w rozcieńczeniu 1: 500 króliczej surowicy anty-HBD-2 w buforze do rozcieńczania przeciwciał (0,25% Blotto w roztworze soli buforowanym fosforanem zawierającym 0,01% timerosalu jako środek konserwujący). Bloty przemywano 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w roztworze buforowanym Blotto TRIS (0,9% chlorek sodu i 20 mM TRIS-chlorowodór, pH 4,5 do 5,0) trzykrotnie przez 10 minut za każdym razem. Błony inkubowano w rozcieńczeniu 1: 2000 sprzężonej z fosfatazą alkaliczną koziej antirabbitowej IgG w buforze do rozcieńczania przeciwciał przez jedną godzinę, a następnie przemyto trzykrotnie, jak poprzednio, i opracowano w roztworze do wywoływania fosfatazy alkalicznej (fosforan bromochloroindolilu-nitroblue tetrazolium).
Do pomiaru LL-37 przeprowadzono analizę immunototową. Pozytywne kontrole i krzywe standardowe wytworzono za pomocą syntetycznego peptydu LL-37 (C-końcowy, 18-merowy fragment, sekwencja aminokwasowa, CZQPIKDFLRNLVPRTES, masa cząsteczkowa, 2204). Peptyd rozcieńczono seryjnie od 50 do 1600 nM; 100 .l każdego wzorca peptydowego i 5 .l każdej próbki (równoważnej 0,5 mg tkanki), ekstrahowanej w sposób identyczny jak dla pomiarów HBD-2, kropkowano trzykrotnie na membranie nitrocelulozowej. Membranę blokowano 10% beztłuszczowego mleka w proszku (Bio-Rad) i 0,1% Tween 20 w soli fizjologicznej buforowanej TRIS w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, a następnie inkubowano w temperaturze 4 ° C przez noc z króliczym przeciwciałem anty-LL-37 rozcieńczonym do dnia. : 2500 w roztworze blokującym
[więcej w: ortodonta warszawa mokotów, lewomepromazyna, integracja sensoryczna terapia ]
[przypisy: krwawienia międzymiesiączkowe, protruzja krążka międzykręgowego, mediklinika ]